Oxydation anaérobie du propane couplée à la réduction des nitrates par une lignée de la classe Symbiobacteriia - Produits chimiques Cie., Ltd de Shijiazhuang

Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 6115 (2022) Citer cet article

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On pense que les micro-organismes anaérobies jouent un rôle essentiel dans la régulation du flux d'alcanes gazeux à chaîne courte (SCGA, notamment l'éthane, le propane et le butane) des écosystèmes terrestres et aquatiques vers l'atmosphère. Il a été confirmé que le sulfate agit comme accepteur d'électrons favorisant l'oxydation anaérobie microbienne des SCGA, mais plusieurs autres accepteurs énergétiquement plus favorables coexistent avec ces gaz dans des environnements anaérobies. Ici, nous montrons qu'un bioréacteur ensemencé avec de la biomasse provenant d'une installation de traitement des eaux usées peut effectuer une oxydation anaérobie du propane couplée à une réduction des nitrates en diazote gazeux et en ammonium. Le bioréacteur a fonctionné pendant plus de 1 000 jours et nous avons utilisé des expériences de marquage au 13C et 15N, ainsi que des analyses métagénomiques, métatranscriptomiques, métaprotéomiques et métabolites pour caractériser la communauté microbienne et les processus métaboliques. Les données suggèrent collectivement qu'une espèce représentant un nouvel ordre au sein de la classe bactérienne Symbiobacteriia est responsable de l'oxydation du propane dépendante du nitrate observée. Le génome fermé de cet organisme, que nous désignons sous le nom de « Candidatus Alkanivorans nitratireducens », code les voies d'oxydation du propane en CO2 via l'ajout de fumarate et de réduction des nitrates, avec tous les gènes clés exprimés lors de l'oxydation du propane dépendante des nitrates. Nos résultats suggèrent que le nitrate est un puits d'électrons pertinent pour l'oxydation du SCGA dans les environnements anaérobies, constituant un nouveau lien à médiation microbienne entre les cycles du carbone et de l'azote.

Une quantité considérable de gaz naturel est générée à partir de sédiments des grands fonds marins et de suintements d’hydrocarbures dans les marges continentales et les écosystèmes terrestres1,2. La majeure partie du gaz naturel rejeté est consommée par des micro-organismes dans les zones anoxiques avant que le gaz ne se diffuse dans les environnements oxiques et dans l'atmosphère3,4,5. Les études sur l’oxydation anaérobie du gaz naturel se sont concentrées sur le puissant gaz à effet de serre, le méthane, comme composant le plus abondant (~ 60 à 90 %)6,7. Cependant, les alcanes gazeux à chaîne courte (SCGA), notamment l'éthane, le propane, le n-butane et l'isobutane, sont également des constituants importants du gaz naturel (jusqu'à environ 20 %)8 et sont d'importants précurseurs de l'ozone et des aérosols organiques9. Les émissions atmosphériques mondiales de SCGA sont estimées à 9,2-9,6 Tg an-1 pour l’éthane, 9,6 à 10,5 Tg an-1 pour le propane, 10 Tg an-1 pour le butane et 4,2 Tg an-1 pour l’iso-butane10.

L'oxydation anaérobie du méthane (AOM) a été largement étudiée et est relativement bien comprise7,11,12,13,14,15,16,17. Les archées méthanotrophes anaérobies (ANME) oxydent le méthane via la voie de la méthanogenèse inverse, y compris le complexe clé méthyl-CoM réductase (MCR). L'ANME transporte les électrons du méthane vers les bactéries sulfato-réductrices syntrophiques (SRB)11,12 ou directement vers la réduction des nitrates et des oxydes métalliques13,14,15,16. La bactérie « Candidatus Méthylomirabilis oxyfera » réalise l'OMA via la voie « intra-aérobie » d'oxydation du méthane en utilisant le nitrite comme seul accepteur d'électrons17. Les micro-organismes associent probablement également l’oxydation des SCGA à la réduction de ces accepteurs d’électrons dans des conditions anoxiques18. 'Californie. M. oxyfera' s'est révélé capable d'oxyder l'éthane et le propane via la méthane monooxygénase, bien qu'il reste à démontrer si ces sources de carbone soutiennent la croissance19. À ce jour, le sulfate a été le seul puits d’électrons identifié pour supporter l’oxydation anaérobie des SCGA20,21,22,23,24,25. L'isolat deltaprotéobactérien Desulfosarcina aeriophaga BuS5 oxyde le propane et le butane via la voie d'addition de fumarate générant des succinates alkyl-substitués, un processus médié par l'alkylsuccinate synthase (ASS)20,21, et réduit directement le sulfate en sulfure. Il a été découvert qu'un enrichissement de l'archéon « Candidatus Syntrophoarchaeum » activait le butane via la formation de butyl-coenzyme M, un processus catalysé par un MCR divergent, avec des équivalents réducteurs canalisés vers des partenaires syntrophiques SRB23. De même, l'oxydation anaérobie de l'éthane a été liée au « Candidatus Argoarchaeum ethanivorans », qui codait également pour un complexe de type MCR et a été suggéré pour former une relation syntrophique avec SRB22. Cependant, un archéon capable de médier l’oxydation anaérobie du propane directement couplée à la réduction des sulfates n’a pas encore été identifié.

90% and >70% bootstrap values, respectively. The scale bars indicate amino acid substitutions per site. b A composite fluorescence micrograph of the enrichment culture hybridized with the SYMB-1018 FISH probe (Cy3, red; targeting ‘Ca. A. nitratireducens’) and stained with DAPI (blue; all microbial cells). ‘Ca. A. nitratireducens’ cells appear magenta (blue + red). The scale bar indicates 20 μm. The representative image was selected based on the visual assessment of six separate hybridisation experiments. Consistent results were also obtained independently with two additional probes targeting the ‘Ca. A. nitratireducens’ population (Supplementary Fig. 8). c, d Relative expression of each genome and unbinned contigs, and microbial metabolism of interest for the genomes in the bioreactor. The total transcripts per million (TPM) was calculated for each gene. Genome sets with overall expression of total TPM > 1% are shown (c). KEGG annotation was used to identify ORFs coding for denitrification (M00529) and dissimilatory nitrate reduction to ammonium (M00530) pathways (d). Source data are provided as a Source Data file./p> 147.2) of the enriched culture extracts (n = 3, taken at various time points) revealed a peak at retention time 10.832 min, matching the peak of the iso-propylsuccinate standard. b A peak at retention time 11.078 min (ion transition, m/z: 289 > 147.1), corresponding to the peak from the propylsuccinate standard, was observed for cell extracts from the enriched culture (n = 3 at different sampling points). c Phylogenetic relationship of ‘Ca. A. nitratireducens’ AssA (Red) to other AssA and BssA in the NCBI database. Three AssA subunits (AssA123) found in ‘Ca. A. nitratireducens’ MAG formed a separate cluster. Bootstrap values >90% are shown as black dots on branch nodes. Scale bar represents amino acid substitutions per site./p> 147.2) and propylsuccinate (m/z: 289 > 147.1) standards were detected in the cell extracts (Fig. 4a, b). These findings support the hypothesis that ‘Ca. A. nitratireducens’ activates propane through homolytic C-H bond cleavage at both primary and secondary carbon atoms, and with addition of fumarate, yields propylsuccinate and iso-propylsuccinate. In addition, iso-propylsuccinate (5.96 nM) was more abundant than propylsuccinate (2.33 nM) in the culture extracts, suggesting the secondary carbon atom activation generating iso-propylsuccinate is the main route of propane oxidation (Fig. 5)./p> Q5. Among them, 12 million reads were longer than 1000 bp with read N50 of 6,135 bp. Adapters were trimmed using Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop)./p> 30 was selected and mapped to the KEGG Orthology database. The eggNOG v5 database was searched against using emapper 2.1.5 in diamond mode. Conserved motif(s) present within the predicted genes related to propane oxidation and nitrogen metabolism were further verified using NCBI’s conserved domain search62. Annotated KO numbers were used for inferring the pathway encoded in each genome. Pathways were identified as ‘not expressed’ if missed blocks > 75% when total blocks > 5, or missed blocks > 1 when total blocks ≤ 5./p>92% similarity), the probes were designed against the 16 S sequence of ‘Ca. A. nitratireducens’ and care should be taken in their application beyond well characterised systems. Given there are no cultured representatives available for probe validation, three FISH probes were designed to target different sites on the ‘Ca. A. nitratireducens’ 16 S rRNA to give higher confidence in their specificity. These included the SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) and SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ) probes. Unlabelled helper probes78 were designed to target the flanking regions of each probe site to increase accessibility to the target site for optimal fluorescent signal (SYMB-1018: H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Helper probes were applied in equimolar amounts with their respective probe. The 5ʹ and 3ʹ ends of the oligonucleotide FISH probes were labelled with the Cy3 fluorophore and were synthesized by Integrated DNA Technologies, Singapore. A higher signal was achieved for these FISH probes with lysozyme pre-treatment of the biomass (0.5 mg ml−1 in 0.05 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl, pH 8) for 30 min at room temperature. The Non-EUB nonsense probe was used as a negative hybridization control79. DAPI (1 ng/µl) staining of cells was performed for 15 min in the dark. The labelled biomass was visualized with a Stellaris5 white light laser confocal microscope (Leica, Germany)./p>