Le débordement de formiate entraîne le piégeage du folate toxique dans les cellules cancéreuses inhibées par MTHFD1

Nature Metabolism volume 5, pages 642-659 (2023)Citer cet article

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Les cellules cancéreuses alimentent leur besoin accru d’approvisionnement en nucléotides en régulant positivement le métabolisme à un carbone (1C), y compris les enzymes méthylènetétrahydrofolate déshydrogénase-cyclohydrolase 1 et 2 (MTHFD1 et MTHFD2). Le TH9619 est un puissant inhibiteur des activités déshydrogénase et cyclohydrolase dans MTHFD1 et MTHFD2, et tue sélectivement les cellules cancéreuses. Nous révélons ici que, dans les cellules, le TH9619 cible le MTHFD2 nucléaire mais n’inhibe pas le MTHFD2 mitochondrial. Par conséquent, le débordement de formiate des mitochondries se poursuit en présence de TH9619. Le TH9619 inhibe l'activité du MTHFD1 se produisant en aval de la libération du formiate mitochondrial, conduisant à l'accumulation de 10-formyl-tétrahydrofolate, que nous appelons un « piège à folate ». Cela entraîne une déplétion en thymidylate et la mort des cellules cancéreuses exprimant MTHFD2. Ce mécanisme de piégeage du folate jusqu'alors non caractérisé est exacerbé par les niveaux physiologiques d'hypoxanthine qui bloquent la voie de synthèse des purines de novo et empêchent en outre la consommation de 10-formyl-tétrahydrofolate pour la synthèse des purines. Le mécanisme de piégeage du folate décrit ici pour le TH9619 diffère des autres inhibiteurs et antifolates du MTHFD1/2. Ainsi, nos résultats découvrent une approche pour attaquer le cancer et révèlent un mécanisme de régulation du métabolisme 1C.

Le métabolisme à un carbone (1C) est essentiel à l’approvisionnement en nucléotides pour la synthèse et la réparation de l’ADN. Sans un apport suffisant en nucléotides pour répondre aux demandes prolifératives, les cellules subissent un arrêt du cycle cellulaire ou la mort cellulaire en raison du stress de réplication et de l'instabilité génomique1,2,3. Les enzymes impliquées dans la voie métabolique 1C sont généralement régulées positivement dans le cancer pour produire les nucléotides et les acides aminés nécessaires à une prolifération rapide4,5,6.

Le métabolisme 1C est principalement alimenté par l’acide aminé non essentiel sérine, qui peut être généré à partir de l’intermédiaire glycolytique 3-phosphoglycérate ou fourni à partir de l’espace extracellulaire7. Le catabolisme de la sérine via le métabolisme 1C dépendant du folate est nécessaire à la synthèse des nucléotides. Elle est médiée par quatre réactions enzymatiques réversibles qui se produisent dans les mitochondries et le cytosol (Fig. 1a). La sérine hydroxyméthyl transférase (SHMT) transfère un groupe hydroxyméthyle de la sérine au tétrahydrofolate (THF) pour générer du 5,10-méthylènetétrahydrofolate (CH2-THF) et de la glycine. La méthylènetétrahydrofolate déshydrogénase – cyclohydrolase (MTHFD) oxyde et hydrolyse le CH2-THF en 10-formyl-tétrahydrofolate (10-CHO-THF), qui est ensuite hydrolysé en THF et formiate par la formyl THF synthétase. Dans le cytosol, ces réactions sont catalysées par SHMT1 et le MTHFD1 trifonctionnel, qui comprend deux domaines distincts, le domaine déshydrogénase – cyclohydrolase (DC) et le domaine formyl THF synthétase (FS). Dans la mitochondrie, les mêmes réactions sont catalysées par SHMT2, MTHFD2 bifonctionnel (activité DC) et MTHFD1L (activité FS) (Fig. 1a)8. Bien que des variations existent9, la directionnalité canonique de la voie suit le catabolisme de la sérine et l'oxydation des unités 1C via la mitochondrie, tandis que les unités cytosoliques 1C suivent une voie réductrice (inverse) qui est pilotée par un rapport NADPH:NADP+ cytosolique élevé8,10,11,12. De cette façon, le métabolisme 1C forme un cycle qui se propage entre la mitochondrie et le cytoplasme. En raison de la réversibilité des réactions catalysées par SHMT1 et MTHFD1, la perte du métabolisme mitochondrial 1C peut être compensée via la voie cytosolique13.

a, flux métabolique 1C entre les mitochondries et le cytosol/noyau. b – e, courbes dose-réponse de cellules SW620 traitées pendant 96 h avec TH9619 (b), TH9975 (c), DS18561882 (d) ou SHIN1 (e) en présence de 50 μM de thymidine, 1 mM de formiate de sodium ou d'un véhicule ( cultivé dans RPMI-FBS), signifie ± sd (n = 3). f, taux de libération du formiate dérivé de la [U-13C] sérine de cellules SW620 WT, MTHFD2−/− et SHMT1−/− traitées pendant 24 h avec les concentrations indiquées de TH9619 et TH9975 ou 50 nM de MTX (cultivées dans RPMI-FBS) , signifie ± sd (n = 3 pour le contrôle et TH9619, n = 2 pour TH9975, n = 1 pour MTX) ; ANOVA unidirectionnelle (analyse de variance) avec le test de comparaisons multiples de Tukey. g, Quantification du potentiel de membrane mitochondriale dans les cellules SW620 WT traitées avec 1 µM de TH9619 ou TH9975 ou 0,5 µM de MTX pendant 48 h. FCCP a été utilisé comme contrôle positif. Les données sont affichées sous forme de moyenne ± sd (n = 4, n = 5 pour FCCP) ; ANOVA unidirectionnelle avec le test de Dunnett pour des comparaisons multiples. h, i, analyse CETSA de la stabilisation de MTHFD2 dans des cellules SW620 WT traitées pendant 3 h avec 10 µM de TH9619 ou un véhicule. La stabilisation de MTHFD2 a été évaluée par Western blot en normalisant le signal MTHFD2 restant en HSP60 dans les fractions mitochondriales (h) ou en lamine A/C dans les fractions nucléaires (i). j, immunoblots représentatifs d’une expérience indépendante sur deux. k, analyse DARTS de la stabilisation de MTHFD1 dans des lysats SW620 incubés avec 10 µM de TH9619 ou un véhicule pendant 30 min, suivie d'une digestion des protéines à une concentration croissante de pronase et d'une évaluation de la dégradation de MTHFD1 par Western blot. Le signal MTHFD1 a été normalisé en SOD1. Montré est un représentant de trois expériences indépendantes. l, valeurs moyennes de pIC50 (−log de la concentration inhibitrice demi-maximale) pour les inhibiteurs MTHFD1/2 indiqués évalués pour leur activité inhibitrice contre MTHFD1(DC) WT ou le mutant MTHFD1(DC) (Q100A), moyenne (de gauche à droite n = 4, 9, 2, 19, 5, 15, 5, 6, 4, 8); test t bilatéral non apparié. m, la cassette CRISPR-Select pour MTHFD1-Q100A a été livrée aux cellules SW620. Le graphique montre le rapport MTHFD1-Q100A par rapport au WT aux jours 2 et 25 du traitement TH9619 à 10 μM normalisé à la valeur du jour 2, moyenne ± sd (n = 4) ; Test T apparié et bilatéral.